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last update:06/02/23  

   image ふたつのユビキチンと両面で結合    2006.2.23
 
        〜 アミノ酸配列の繰り返し構造 〜
 
 
  先週のニュースでは、糖鎖を荷札として認識する運び屋タンパク質のお話をしました。細胞の中には、いろいろな物質輸送が絶えず行なわれています。今日は、細胞の外と中の物質のやり取りにかかわるタンパク質を紹介します。このタンパク質は、ユビキチンという小さなタンパク質をめじるしとして、リサイクルすべきものと、分解されるべきものの「分別」を行っています。フォトンファクトリーで明らかになった立体構造から、めじるしを識別する仕組みが明らかになりました。

めじるしタンパク質ユビキチン

ユビキチンとはアミノ酸76個から成る小さなタンパク質で、「いたるところに存在する」という意味のユビキタスというラテン語に由来しています。その名の通り、酵母からヒトにいたるまで、あらゆる真核生物のあらゆる組織に広く存在します。

この小さなタンパク質は、2004年のノーベル化学賞の受賞対象になったことから一躍有名になりました。ユビキチンは、細胞の中で分解されるべきタンパク質に「めじるし」として結合します。要らなくなったタンパク質に「ゴミ」というラベルを貼るようなものです。細胞の中で、不要なタンパク質が正しく分解されるのは、必要なタンパク質を正しく合成されることと同じぐらい重要なことであり、この発見に対してノーベル化学賞が贈られました。

ユビキチンは、タンパク質分解系の他にも、DNAの傷を直すDNA修復過程や、他の細胞との情報交換をするシグナル伝達過程など、さまざまな生命活動においてもめじるしとして働いていることがわかりました。ユビキチンは、どのように結合するかによって、多くの種類のめじるしとなることができます。例えば、「ゴミ」のラベルとしてのユビキチンは、48番目のアミノ酸のリジンのところで他のユビキチン分子と結合し、ユビキチンが数多くつながった「ポリユビキチン」という形のめじるしをつけます。DNA修復のめじるしのときは、同じポリユビキチンでも、63番目のリジンのところでつながった少し違う形のポリユビキチンです。

最近、ユビキチンによる目印のひとつの形として、ポリユビキチンではなく、ユビキチン1分子の付加(モノユビキチン化)、あるいは複数の部位のモノユビキチン化(マルチ-モノユビキチン化)が、エンドサイトーシスと呼ばれる、細胞内の物質輸送のめじるしとして働くことが明らかになってきました。

モノユビキチンのめじるしで分別

細胞が生命活動を行うには、細胞の外と物質のやり取りを行なわねばなりません。このとき、細胞膜表面から細胞内に分子を取り込む機構が重要になりますが、この機構をエンドサイトーシスといいます。細胞内に取り込まれた物質は必要に応じて分解されたり、あるいは分解されず細胞膜に再び戻されたりします。この過程にモノユビキチン化が重要な役割を果たしていることがわかってきました。

Hrsは、この「分別」を行なうタンパク質のひとつです。細胞膜には、細胞外の物質のやり取りのため、さまざまな受容体タンパク質が存在しています。これらの受容体は、たくさん作りすぎて数を減らしたいときや、不要になったときの処理のされ方が違っています。たとえば、栄養物受容体は一度細胞内に取り込まれたあと、細胞膜表面に再び戻されリサイクルされます。一方、成長因子受容体は細胞内に取り込まれると、リサイクルされることなくリソソームというオルガネラに送られ分解されます。わたしたちの社会では、リサイクルされるゴミ、焼却場に送られるゴミ、というようにゴミを分別して処理していますが、同じような分別が細胞の社会の中でも起こっているのです。

モノユビキチン化が重要な役割を果たしているのは、この分別過程です。細胞内に取り込まれるとき、成長因子受容体はモノユビキチン化されており、このユビキチンをめじるしとして、初期エンドソームと呼ばれるオルガネラで分別が行なわれます(図1)。Hrsには、UIM(Ubiquitin interacting motif;ユビキチンと相互作用する領域)と呼ばれる20アミノ酸から成る領域があり、この領域がユビキチンと相互作用することによって分別を行なっています。その後、別のタンパク質の働きにより、成長因子受容体は最終的にリソソームに送られ分解されます。

らせんの両側に結合する2つのユビキチン

KEK構造生物学研究センターの若槻壮市(わかつき・そういち)教授、平野聡(ひらの・さとし)博士らは、モノユビキチン化されたタンパク質がどのような仕組みで分別を受けるのか理解するため、分別タンパク質Hrsのユビキチン相互作用モチーフUIMとユビキチンの相互作用を、タンパク質の立体構造から明らかにしたいと考えました。分別タンパク質Hrsのユビキチン相互作用モチーフUIMとユビキチンの複合体の結晶は、フォトンファクトリー・アドバンストリングのタンパク質結晶構造解析ビームラインAR-NW12Aで行なわれました。

図2がその複合体の構造です。Hrs-UIMは1本のαヘリックスから成るシンプルな構造で、そのUIMをはさみ込むように2つのユビキチンが結合していました。これまでにも他のタンパク質でユビキチン相互作用モチーフとユビキチンとの複合体構造が解析された例はありますが、それらの結合比率は1対1の結合であり、今回のような1つのUIMに対して2つのユビキチンが結合している例は今までにない、全く新しい構造です。

さらに驚くべきことに、2つのユビキチンは、UIMの全く逆方向からはさみ込むように結合しているのにもかかわらず、非常によく似た結合パターンで結合していることがわかりました(図3)。

美しい繰り返し配列

なぜこのようにHrs-UIMは2つのユビキチンと相互作用できるのでしょうか? 秘密はHrs-UIMのアミノ酸配列にありました。

図4の中央の黒で書かれた文字はHrs-UIMのアミノ酸配列を表しています。Lはロイシン、Qはグルタミン、というように、アルファベットの1文字が1種類のアミノ酸に対応します。図4の緑色で示した部分は、このアミノ酸配列から、1つ目のユビキチン認識に関わる部分を抜き出したものです。同様に、水色で示した部分は2つ目のユビキチン認識に関わる配列です。水色はアミノ酸2つ分、緑色よりずれた位置にあります。しかも水色と緑色の配列を比べると、非常によく似ていることがわかります。特に結合に重要なアミノ酸を網付きであらわしていますが、網付きの部分は全く同じであることがわかるでしょう。

αヘリックスでは、アミノ酸2つ分ずれた部分は、もとのアミノ酸から見ると、ほぼヘリックス(らせん)の反対側にあたるのです。したがって、結合に必要なアミノ酸の2個後ろに同じアミノ酸があれば、ヘリックスの反対側にもうひとつ結合部位ができることになります。このHrs-UIMの2個ずらしても同じ配列という、美しい繰り返しの配列が2つのユビキチン結合を可能にしているのです。このような配列はすべてのUIMについて当てはまるわけではなく、通常のUIMは図4の緑色のようなモチーフは持っていますが、水色に相当する2つ目のモチーフは持っていません。このような通常のUIMを片面結合型UIMと呼ぶとすれば、Hrs-UIMのような配列をもつUIMは両面結合型UIMといえます。

なぜHrs-UIMは2つのユビキチン結合部位を持つのでしょうか。UIMとユビキチンの相互作用は非常に弱いことが知られており、1:1の結合だけでは分別が効率よく行なえないのかもしれません。また、Hrs-UIMで認識する対象タンパク質が、マルチ-モノユビキチン化されて多くのユビキチンを持つことから、Hrs-UIMが同時に2つのユビキチンと相互作用することにより、分別を正しく行なえるようになっていることが考えられています(図5)。

この研究は、科学雑誌 "Nature Structural & Molecular Biology" に掲載されました(オンライン版は2月5日に発行)。

捨てられるはずだった結晶

このタンパク質複合体の結晶を得たときのエピソードを平野博士に語ってもらいました。

タンパク質の立体構造を調べるためには、タンパク質の結晶が必要ですが、それはどのようにして得られるのでしょうか? 以前このニュースで、タンパク質の結晶を育てるロボットの話がとりあげられましが、沈殿剤というタンパク質の溶液の溶解度を下げる働きをする物質を用いて、タンパク質を溶けきれなくすることで結晶を生じさせます。しかし、どんな沈殿剤を用いてもタンパク質の結晶が得られるわけではなく、“相性の良い”条件でなくては結晶を得ることはできません。このような“相性の良い”条件を探すために、我々は少なくとも数百条件という結晶化条件を試みます。この結晶を得る条件を探す段階こそが、タンパク質の結晶構造解析を行ううえで、もっとも難しい段階のひとつです。

たくさんの結晶化条件を試すために、結晶化は普通、多くのウェル(結晶を作るための小さな容器)を持つ結晶化プレートを使って行われます。プレートは、タンパク質と沈殿剤を混ぜた後、振動の少ない、温度が一定な場所に静置され、時々観察されます。タンパク質結晶の多くは、最初の1〜2週間ぐらいで現れるため、最初の2週間ぐらいは2〜3日おきと、頻繁に観察されます。しかし時間が立つとプレートの中身が蒸発して干からびていくので、もう結晶は出ないだろうと思われる古いプレートは、最終的に捨てられる運命にあります。Hrs-UIMとユビキチンの複合体結晶はこのような、捨てられるはずのプレートから偶然、発見されました。

この複合体の結晶化の時も通常と同じように、タンパク質と沈殿剤を混合後、静置され観察が続けられましたが、最初の1ヶ月半では結晶が全く現れませんでした。この条件では、結晶が出ないと判断され、プレートは廃棄されるところでしたが、プレートの保管場所にたまたま余裕があったので、念のため、そのままとっておかれました。タンパク質との混合後5ヶ月たったときに、いよいよ保管場所を整理する必要に迫られました。混合後5ヶ月も経過したプレートは、半ば干からびたよう状態であったため、タンパク質の結晶があるとは思われませんでしたが、念のためのチェックが行なわれたところ、なんと図6(上) のような結晶が発見されました。このような“汚い”結晶では構造解析を行なうことはできませんが、この条件を元に結晶化条件の最適化を行ったところ、図6(中央) のような結晶を得ることができ、結晶構造解析を行うことができるようになりました。

この結晶化の沈殿剤濃度は元の沈殿剤濃度よりも45%も高く、長期間置いておかれて、乾燥したことが結晶を得る原因になったと思われます。さらに条件検討を重ね、最終的に図6(下) のような大きな結晶を得ることができ、より良い精度で結晶構造解析を行えるようになりました。もしプレートを捨てるときに結晶があるかどうかのチェックをしていなかったら、この構造解析は行なうことが出来なかったでしょう。また、最初にこの条件では出ないと思った段階で捨てていたら、やはり結晶は得られていませんでした。タンパク質の結晶は、ときにこのような偶然で得られることがあります。

タンパク質のきれいな結晶を得るために研究者は日夜たいへんな努力を積み重ねています。捨てられるはずのプレートから見つかった結晶から新発見が生まれるというのも努力の「結晶」なのかもしれませんね。



※もっと詳しい情報をお知りになりたい方へ

→放射光科学研究施設(フォトンファクトリー)のwebページ
  http://pfwww.kek.jp/indexj.html
→構造生物学研究センターのwebページ
  http://pfweis.kek.jp/index_ja.html
→文部科学省タンパク3000プロジェクトのwebページ
  http://www.mext-life.jp/protein/

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[図1]
初期エンドソーム上における成長因子受容体の選別。成長因子受容体は、エンドサイトーシスによって取り込まれ、初期エンドソームに送られる。このとき成長因子受容体は(マルチ-)モノユビキチン化されている。このユビキチンを標識としてHrs-STAM-Eps15からなる“選別複合体タンパク質”が成長因子受容体を選別する。選別された成長因子受容体は多胞体からリソソームに送られ分解される。
拡大図(42KB)
 
 
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[図2]
分別タンパク質Hrs-UIMとユビキチンの複合体の全体構造。上)上面、下)側面。中央のマゼンタのらせんが分別タンパク質HrsのUIM。左右の緑色(ユビキチンA)、水色(ユビキチンB)の分子がユビキチン。1本のHrs-UIMが2つのユビキチン分子にはさまれている。
拡大図(76KB)
 
 
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[図3]
Hrs-UIMとユビキチンの相互作用面。両方のユビキチンとも同じ面でHrs-UIMと相互作用している。Hrs-UIMとユビキチンの相互作用の形式はほぼ同じである。
拡大図(85KB)
 
 
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[図4]
Hrs-UIMの繰り返し配列。中央はHrs-UIMの配列。上段の緑色で示した配列はユビキチンAとの相互作用にかかわる配列。下段の水色で示した配列はユビキチンBとの相互作用にかかわる配列。網で囲った部位は特に結合に重要なアミノ酸残基。斜体は結晶構造中で確認されていないアミノ酸残基である。緑色の配列と水色の配列はよく似ていることがわかる。Hrs-UIMは2個ずれても同様の配列を与える繰り返し構造をしている。
拡大図(12KB)
 
 
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[図5]
Hrsとユビキチン化タンパク質との相互作用のモデル図。ユビキチン化されたタンパク質は、通常2箇所以上モノユビキチン化されている(マルチモノユビキチン化)。この2つのユビキチンとHrs-UIMが同時に結合することによってより強い結合になると考えられる。
拡大図(24KB)
 
 
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[図6]
Hrs-UIMとユビキチンの複合体結晶。上)5ヶ月放置されたプレートから発見された最初の結晶。中央)最初にデータ測定に成功した結晶。下)最終的に構造解析に利用した結晶。写真中の棒は0.1mmの長さを表す。
拡大図上(80KB)
拡大図中(25KB)
拡大図下(39KB)
 
 
 
 
 

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